|
|
Isolement d'ADN chez Synechocystis
L'isolement
de l'ADN total de Synechocystis sp. PCC 6803 est effectué
selon la méthode décrite par Franche und Damerval
(1988). Les cyanobactéries sont centrifugées (4000
x g, 10 min) en phase logarythmique de croissance. Le sédiment
de 250 ml de culture est ensuite lavé à l'aide
de 5 ml de tampon TE, repris dans 5 ml de tampon Saccharose
et congelé dans de l'azote liquide.
| Tampon TE: |
10 mM Tris/HCl
pH 7,0 |
| |
1 mM EDTA, pH 8,0 |
| Tampon Saccharose: |
25% w/v Saccharose |
| |
50 mM Tris/HCl pH 7,0 |
| |
100 mM EDTA, pH 8,0 |
Le culot est laissé décongéler
une heure à 37°C dans une solution ph 8 contenant 5
mg/ml de Lysozyme et 100 mM d'EDTA. A la solution sont ensuite
ajoutés la Proteinase K (100 µg/ml) et du SDS (concentration
finale 2%) puis l'incubation se fait à 37°C toute la
nuit.
Le lendemain, le lysat cellulaire est extrait en utilisant par
2 fois un volume équivalent de Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
(25:24:1). Dans chacune des centrifugations (4000 x g; 10 min)
qui s'ensuivent, une séparation de phase s'opère.
La phase aqueuse résultante est traitée par un volume
du mélange Chloroform/Isoamylalkohol et à nouveau
centrifugée 10 min. à 4000 x g.
La précipitation de l'ADN est ensuite effectuée
grace à l'ajout de 0,7 volume d'isopropanol, à l'incubation
de la solution 30 min puis à sa centrigation à 12000xg.
Il s'ensuit une étape de lavage avec de l'éthanol
70% et un séchage sous vakuum. Le culot d'ADN est ensuite
dilué dans 100-500 µl d'eau distillée. aufgenommen.
|
|
|
